新撰組局長，天然理心流宗師。
新撰組局長
然而浪士組的招集人清河八郎事實上是個勤王論者，佐幕上京維持治安只是一個藉口罷了。在清河八郎向朝廷提交的建白書內容，以及隨後在壬生村新德寺向浪士們宣稱成立「浪士組」的真正目的並非保衛京都安全，而是勤王的先鋒，再再說明了浪士組只不過是他用來增大自己勢力的棋子。
看透清河立場的近藤與水戶鄉士芹澤鴨等人強力反對清河，最後共24人留駐京都。京都守護職會津藩主松平容保向幕府遞交嘆願書說明狀況後，將剩餘浪士納入京都守護名下。改名為「壬生浪士組」，開始了守護京都治安，防止勤王派浪人肆意破壞、暗殺（天誅）、縱火之活動。此時近藤勇29歲。
然而壬生浪士組成立之初波折不斷，組內暗殺致死事件多傳。文久三年（1863年）3月25日，為壬生浪士組成員之一殿內義雄客死他鄉（另說為暗殺）。根岸友山一派成員粕谷新五郎脫離浪士組，阿比留榮三郎病死（一說為暗殺），家里次郎切腹。最後壬生浪士組大致上以近藤勇的試衛館派（試衛館成員）與芹澤鴨的水戶天狗派（水戶天狗黨等人）的3局長模式共同管理壬生浪士組事務。
文久三年8月18日（1863年9月29日），薩摩藩與會津藩的公武合併派朝臣密謀把長州藩公卿中川宮朝彥親王（尹宮）趕出京都政治圈，對此感到憤慨的長州藩激進派浪人與防守堺町門的薩摩藩與前來支援的會津藩衛士發生武裝衝突，史稱八月十八日政變。在政變中，壬生浪士組守護御花園門有功，由朝廷下賜「新撰組」一名。文久三年(1863年)9月16日(一說18日)，芹澤一派被試衛館派暗殺成功，新撰組因而再度改變成為近藤勇主導的中央集權體制。
元治元年（1864年）6月，熊本藩宮部鼎藏同志之一古高俊太郎遭新撰組捕獲，受不了土方歲三嚴刑的古高俊太郎透露了長州藩企圖火燒中川宮邸，以及綁架天皇至長州藩之計畫。擔心宮部鼎藏得知後會提早行動的新撰組分頭搜索京都，並於旅館池田屋找到正在商議行動的宮部一派，近藤勇,沖田總司,永倉新八,藤堂平助首先衝進去廝殺,以十人殲滅池田屋裡面尊王攘夷派人士約三十人，後世稱為池田屋事件。得知消息後的幕府公開致贈感謝狀與賞金錶揚新撰組功勞。禁門之變後，近藤勇為了募集團員歸鄉。隨後接納伊東甲子太郎入隊。慶應元年（1865年），侍奉永井尚志前往廣島。接著慶應三年，近藤勇正式成為幕臣，並得到御目見得(可與將軍面見議事)的身分，近藤勇可以幕府代表的身分與各要人談判交涉。
慶應三年（1867年）3月20日，伊東甲子太郎以監視薩摩藩名義組織御陵衛士，與新撰組分離。藤堂平助、齋藤一(近藤的臥底)也加入其中。11月18日，在近藤勇的策劃下，伊東甲子太郎在回家途中於油小路遭到大石鍬次郎等人暗殺。之後更誘出剩下御陵衛士圍剿之。御陵衛士派的報復行動則是在同年12月18日，於伏見街道遭到御陵衛士殘黨槍擊負傷，因故無法指揮新撰組參加鳥羽伏見之戰而在大阪城療傷。
